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単純ヘルペスウイルス型に対するプロバイオティクス細菌Lactobacillus rhamnosusの効果のin vitro研究1

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単純ヘルペスウイルス1型に対するプロバイオティクス細菌Lactobacillus rhamnosusの効果のin vitro研究

Soghra KhaniI;Mohammad MotamedifarI,*;Hossein GolmoghaddamII;Hamideh Mahmoodzadeh Hosseiniii; Zahra HashemizadehI

イラン-シラーズ医科大学シラーズHIV/エイズ研究センター(SHARC)細菌学-ウイルス学IDepartment
イラン-シラーズ医科大学免疫学Iidepartment
イラン-タブリーズ医科大学学生研究委員会薬局学IIISchool

ABSTRACT

背景:単純ヘルペスウイルス1型(Hsv-1)における薬剤耐性の出現により、研究者は単純ヘルペスウイルス1型感染症を治療するための他の方法を見つけようとしている。 Probiotic細菌は大食細胞の活発化で有効で、抗ウイルス性の活動があるかもしれません。
目的:本研究は、プロバイオティクス細菌であるLactobacillus rhamnosusが、非プロバイオティクス細菌である大腸菌と比較してHSV-1感染に対する直接的な効果を検証し、HSV-1感染のin vitro排除に対するマクロファージ活性化に対する効果を決定することを目的とした。
方法:上記の細菌をHSV-1感染Vero細胞に導入し、MTTおよびプラークアッセイの両方を用いてその効果を調べた。 In vitro HSV-1感染に対するマクロファージ活性化を決定するために、J774細胞は、これらの細菌にさらされた;その後、マクロファージの生存率は、MTT法で調べ、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、インターフェロン-γ(IFN-γ)、および一酸化窒素(NO)評価は、ELISA法を用いて行われた。
結果:非プロバイオティクス細菌としての大腸菌と比較した場合、HSV-1感染前後のLactobacillus rhamnosusの存在下でマクロファージの有意な生存率の増加が観察された(p<0.05)。 しかし、大腸菌処理J774細胞によって産生される腫瘍壊死因子α濃度は、Lactobacillus rhamnosus処理J774細胞よりも有意に高かった(p<0.05)。 インターフェロン-γおよびNO産生は,大腸菌またはLactobacillusrhamnosusで処理した群で差はなかった。
結論:本研究の結果は、Lactobacillus rhamnosusは、非プロバイオティクス大腸菌と比較して、HSV-1除去およびHSV-1に対する活性化のためのマクロファージ生存率をより効果的に また、マクロファージ部位の受容体占有は、研究された細菌の両方によるHSV-1感染力を低下させると思われる。

キーワード:Probiotic;Lactobacillus rhamnosus;単純ヘルペスウイルス1型

はじめに

単純ヘルペスウイルス-1(HSV-1)は、二つのタイプの感染を引き起こす可能性があります。 最初の感染は、ほとんどの場合無症候性であり、上皮細胞を含み、感覚神経節に潜伏することができる。 少数の感染させた個人では、潜伏ウイルスは異なった圧力の条件、例えば日光、ホルモン性変更、風邪の痛みとして現われる熱の下で活動化させます。1HSV-1は、歯肉口内炎、咽頭炎(咽頭炎)、ヘルペス性ウィットロー、角結膜炎、ヘルペス脳炎および髄膜炎などの多くの疾患の薬剤である。 免疫抑制患者では、それは慢性的な破壊的過程であり得る。1-3HSV-1に対する特異的および非特異的防御機構の両方が重要である。 宿主遺伝的背景、マクロファージ、NK細胞、およびt細胞および抗体は、HSV-1.1に対する防御において重要な因子であり、2マクロファージ活性化はまた、ウイアシクロビル、vidarabine、famciclovir、valacyclovir、pencyclovirを含む4つの抗ウイルスの薬剤はHSV-1伝染の処置で広く利用されています。1,2今日では、ウイルスDnAポリメラーゼとチミジンキナーゼの変異の発生は、アシクロビルなどのヌクレオシド類似体に対する薬剤耐性の増加につながっている。4,5適切な選択肢を見つけるために、研究者はHsV-1感染症のための新しい化学的および植物的治療源を求めることを示唆している。6-10

HSV-1に対する特異的および非特異的な宿主防御の役割を考慮すると、いくつかの治療法は、HSV-1に対する先天性および特異的な免疫系のコンポーネ 最初の防御ラインは、i型インターフェロン(IFN)および腫瘍壊死因子(TNF)などのサイトカインの産生および分泌である。 その後、IL-12およびIFN-γが産生され、それによってナチュラルキラー細胞およびマクロファージ活性化が生じる。 活性酸素ラジカル(ROS)およびNOの産生は、抗ウイルス応答を改善するための補助的なメカニズムである。12-15マクロファージは、細菌のリポ多糖、マンノース、および非メチル化CPGリピートなどの分子の受容体を持っています。16これらの因子の組み合わせによるシグナルは、ウイルスなどの病原体に対して、自然免疫系を強化し、特定の免疫系、特にT細胞を活性化する広い範囲のサイトカインの分泌を増加させる17、18その中で、INF-γは、マクロファージで抗菌活性を含む様々な活性を開始し、細胞内病原体の根絶を引き起こす。 マクロファージ活性は、感染細胞におけるウイルス増殖(HIV、HSV、VZV)を防止するための最初のステップの一つです。 また、マクロファージによる抗原処理およびTh1リンパ球への提示は、細胞性免疫を誘導する。15-18炎症応答におけるマクロファージの誘導は、自然免疫防御システムでもありません。19NOには、感染細胞、腫瘍細胞、および寄生虫病原体を殺すなどの異なるタスクがあります。 様々なウイルス感染におけるNOの抗ウイルス効果も文書化されている。20

乳酸菌やビフィズス菌などのプロバイオティクス細菌は、通常、ヒトおよび動物の消化管で乳製品を発酵させ、免疫系のバランスをとり、特異的および非特異的な免疫応答を増加させることができる。 それらはウイルス(HIV、VZV)のような病原体に対するボディの防衛の免疫調節の細菌として重要です。21,22さまざまな調査はLactobacillus rhamnosus(緊張GG)、probiotic細菌の種が幼児のRotavirusの胃腸炎の処理で、有利な効果をもたらすことを示しました。23,24in vitro系、動物モデル、およびヒトからのいくつかの研究は、プロバイオティクスが特異的および非特異的免疫応答の両方を増強できることを示唆25,26

ある研究では、モルモットで乳酸菌を摂取すると抗インフルエンザ効果があることが実証されました。 また、1×109cfu/mLの乳酸菌を摂取すると、HSV-2によって引き起こされる性器ヘルペスの合併症が減少する。27別の研究では、ロタウイルス、アストロウイルス、カリシウイルス、腸内アデノウイルスおよびコロナウイルスによって引き起こされるウイルス性下痢の予防および治療に対するプロバイオティクス細菌の効果がレビューされ、ウイルス性下痢を制限する際のプロバイオティクス細菌の有用な役割が文書化された。26in vitro研究では、プロバイオティクス細菌がマクロファージを活性化することにより、小胞性口内炎ウイルス(VSV)に対する抗ウイルス応答を増加させるこ11

だから、HSV-1で観察された抗ウイルス薬耐性の出現は、HSV-1感染を治療するための他の選択肢を見つける必要があります。 ウイルス感染の除去におけるマクロファージの重要な役割とウイルス感染(HSVを含む)の除去におけるプロバイオティクス細菌の有効な役割を考慮して、本研究は、1)乳酸菌rhamnosus、HSV-1に対するプロバイオティクス細菌の直接的な効果、および2)hsv-1感染のin vitro排除のためのマクロファージの活性化に及ぼす影響を調査することを目的とした。 このように、HSV-1伝染を禁じるprobioticsの可能な使用は代わりとなる処置として科学的に証明されます。

方法

細菌および細胞毒性アッセイ

Lactobacilli rhamnosus(PTCC1637)および大腸菌(PTCC25923)の凍結乾燥標準株は、イラン科学技術研究機構(テヘラン、イラン)によって提供された。 乳酸菌rhamnosusは、一晩37℃で嫌気性条件下でマンRogosaシャープ(MRS)ブロス(Himedia-インド)によって補充されたL-システインHCLの対数相成長に培養した。 単一の細菌コロニーを単離するために、収穫されたブロスをMrs寒天(Himedia−india)に移し、記載された条件下で2 4〜3 6時間インキュベートした。

抗ウイルスアッセイに導入された細菌の最大数は、マクロファージ細胞株J774に細胞傷害性ではなかった細菌の最大数として決定された(データは示さ この値は、各株の1×1 0 8CFU/mLであると決定した。<1 6 6 4><7 1 3 1>刺激実験のために1×1 0 8CFU/mlの生菌を調製するために、単離されたコロニーをPBS中に懸濁した。 光学密度(OD)は、分光光度計により5 3 0nmで測定した。 コロニー濃度は、内部Mcfarland標準OD比較により決定した。

付着細菌の割合は、マクロファージ細胞株と細菌を90分間、37℃で、5%のCO2の加湿雰囲気中で共インキュベーションすることによって決定された。 PBSで2回洗浄することにより、非付着性細菌を細胞培養物から除去した。 細胞を採取し,付着細菌の割合をMRS寒天にめっきした連続希釈懸濁液の寒天プレート数によって決定した。 不活性化された細菌懸濁液を調製するために、培養物を1×1 0 8CFU/mL計数で凍結し、沸騰水中で3サイクル解凍した。 また、E.coliを、EMB寒天(Merck−Germany)中で、3 7℃で一晩対数相成長まで成長させた。11

ウイルス

HSV-1は、患者の唇病変から単離され、モルモット抗HSV-1血清(NIH-USA)とhsv糖タンパク質DおよびGに対するモノクローナル抗HSV-1抗体を用いた中和試験28

HSV-1を、2%ウシ胎児血清(Gibco-Germany)、0.14%(v/v)重炭酸ナトリウム、100U/mLペニシリン、100μ g/mL硫酸ストレプトマイシン、および0.25μ g/mLアンホテリシンBを補充したDulbeccos modified Eagles growth medium(DMEM、Sigma)の維持培地中で、Vero細胞株で106/mLの力価まで増殖させた。-使用されるまでの70º c。 抗ウイルスアッセイのために、100μ lのウイルスをmL当たり50%のプラーク形成単位で使用した。<1 6 6 4><7 1 3 1>細胞<1 6 6 4><7 1 3 1>マウス単球/マクロファージ細胞株J7 7 4細胞は、Pasteur Institute,Tehran,Iranから入手した。 それらを、1 0%ウシ胎児血清(FBS)を含有するRPMI1 6 4 0培地(Gibco−Australasia)中で合流するまで増殖させ、組織培養フラスコ(Nunc−Denmark)中に1 0 0μ g/mlストレプトマイシンおよび1 0 0IU/mlペニシリンを補充し、3 7℃、5%CO2の雰囲気中で添加した。

また、コンフルエントVero African green monkey腎臓細胞(Razi Institute、Hesarak-Iran)をDMEMで調製し、8%ウシ胎児血清を補充した。 Vero細胞維持のために、2%ウシ胎児血清のみを補充したDMEM培地を使用した。 細胞生存率を評価するために,トリパンブルー色素(Merck-Germany)排除法を行った。29

プラークアッセイ

HSV-1に対する研究された細菌の可能性のある阻害効果は、前述のようにプラーク減少アッセイを用いて調べた。1 0リン酸緩衝生理食塩水(PBS)−2 4ウェルプレート(Nunc−Denmark)中で洗浄した合流性Vero細胞を、プレート(Nunc−Denmark)を含有する維持培地で処理した。 それらを最初に、1×1 0 8CFU/mlの大腸菌およびL.rhamnosusの生または細菌残屑懸濁液を含む維持培地で9 0分間処理し、次いで5 0PFU/1 0 0μ l H SV−1で4 0分間処理した。 記載された条件下での別の一連の実験では、細胞は最初にウイルスに曝露され、次に細菌に曝露された;それらはまた、細菌およびウイルスに同時に曝露された。 これらの処理を除去した後、単層を5 0PFU/mlのHSV−1で1時間感染させた。 続いて、単分子層は、維持培地中の1%カルボキシメチルセルロース(CMC)で覆われ、37℃で5%CO2四日間インキュベートした。 実験の各シリーズのためのコントロールは、非感染細胞単層、および細菌でウイルス感染処理または未処理の細胞を含んでいました。 細胞上に形成されたウイルスプラークをメタノールで10分間固定し、0.5%結晶紫色溶液で染色した。28

MTTアッセイ

MTTアッセイ(3-4,5dimethyl thiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)(Sigma-USA)を使用して、測定された活性ミトコンドリア代謝機能に従って生きている細胞を評価した。 このアッセイは、抗ウイルス剤の潜在的な有益な効果を示すことができた。簡潔には、9 0μ lの細胞懸濁液の連続希釈液を含有する9 6ウェルプレート上でのインキュベーション期間(5%CO2の存在下、3 7℃で2 4時間)の後に、1 0 0μ lの細胞濃度1 × 105, 5 × 104, 2.5 × 104, 1.25 × 104, 6,250 細胞/mL、ウェルを洗浄した。 次いで、1 0μ lのレディMTT色素を添加した。 プレートを37℃で3-4時間インキュベートした。 この期間の後、内容物を3 0 0rpmで1 0分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を1 0 0μ lのDMSO中に懸濁した。 各ウェルの光学密度を、ELISAリーダーを使用して、5 7 0nmで決定した。30

HSV-1感染Vero細胞に対するL.rhamnosusで処理されたJ774細胞培養上清の効果のアッセイ

1×105細胞/mLのJ774細胞を24ウェルプレート中で、37℃、5%CO2の存在下、24時間インキュベートした37℃、5%CO2の存在下、24ウェルプレート中でインキュベートした。; 1×1 0 8CFU/mLの生きているおよび/または細菌の破片懸濁液を、別個の井戸プレートに加えた。 PBS洗浄の前に、細胞を3 7℃に9 0分間放置して、細菌を細胞に付着させた。 プレートは、NOおよび他のサイトカインが放出されるまで、37℃で5%CO2の存在下でさらに48時間インキュベートした。 次の段階で、細菌で処理したJ7 7 4細胞の上清9 0μ lを、5 0PFU/1 0 0μ lのHSV−1感染Vero細胞を含むプレートに移した。 4 5分後、上記のように、MTT試験を使用して、生存細胞の割合を測定した。 非感染Vero細胞および細菌で処理したJ7 7 4細胞の遊離上清を含むウェルを対照と考えた。

HSVに対するJ774細胞株活性化に対するl.rhamnosusの効果のアッセイ-1

24-1×105細胞/mLのJ774細胞の時間インキュベートプレートに、1×108CFU/mLの生きているおよび/または細菌破片懸濁液を90分間接種し、その後、50PFU/100HSV-1で40分間感染させた。<1 6 6 4><7 1 3 1>別の一連の実験では、細胞に5 0PFU/1 0 0μ lのHSV−1を4 0分間感染させた後、1×1 0 8CFU/mlの生きたおよび/または細菌残渣懸濁液を9 0分間接種した。<1 6 6 4><7 1 3 1> プレートを37℃で5%CO2の存在下で24時間インキュベートした。 代謝的に活性な細胞の割合は、記載されたように、MTT試験によって決定した。 ウイルスも細菌も含まない井戸は陰性対照と考えられた。 MTT試験を実施する前に、全ての細胞の上清を回収して、NO、InfyおよびTnf Αレベルを測定した。

測定なし

NO濃度を測定するために、Griess反応を用いて放出されたNOのレベルを測定した。31インキュベートした1×108細胞/mLのJ774細胞のみ、L.rhamnosus、不活性化L.rhamnosus、E.coliおよび不活性化E.coliで処理したJ774細胞からの上清100μ lを、5%CO2の存在下、37℃で48時間、 室温で10分間インキュベーションした後、450nmでの吸光度を測定した。 NOの濃度は、Nano2標準曲線を使用して計算した。<1 6 6 4><7 1 3 1>InfyおよびTnf Αレベルの測定<1 6 6 4><7 1 3 1>infyおよびTnf Αレベルを、市販のenzyme−linked immunosorbent assay(ELISA)キット(Bender Medsystem−USA)を使用して、製造業者の指示に従って検出した。 インキュベートした1×108細胞/mLのJ774細胞のみ、L.rhamnosusで処理したJ774細胞、不活性化したL.rhamnosus、E.coliおよび不活性化したe.coliからの上清100μ lを、5%CO2の存在下、37º Cで48時間、ELISAプレートに別々に添加した。

統計分析

すべての統計分析は、Statistical Package for Social Sciences(SPSS)バージョン11.5ソフトウェア(Chicago,IL,USA)を使用して実施した。 2つの群(L.rhamnosusおよびE.coli)の間の差を、Mann−Whitney試験を用いて試験した。 J7 7 4細胞のみを対照として使用した。 0.05以下のp値は、統計的に有意であると考えられた。

結果

L.rhamnosusはHSV-1感染Vero細胞の生存率を有意に向上させた

L.rhamnosusはHSV-1感染Vero細胞の生存率を有意に向上させた

L.rhamnosusはHSV-1感染Vero細胞 rhamnosusはVero細胞のHSV-1プラークを減少させた

HSV-1感染したVero細胞(83.3±2.08)と比較して、プラークの有意に低い数は、L.rhamnosusで処理されたVERO細胞培養で検出された前または後のHSV-1感染(68.1±1、71±2、それぞれ)。 HSV-1プラークの統計的に同様の減少は、大腸菌に暴露されたVero細胞で観察された。 (表1)。

l.rhamnosusおよび大腸菌で処理したマクロファージJ774培養の上清は、図に示すようにVero細胞生存率を有意に増加させた

。 図2に示すように、生および/または不活性L.rhamnosusを有する前処理マクロファージJ774細胞の上清は、ウイルスのみに感染した細胞と比較してVero細胞の生存率(74.9 ± 0.95 – 51 ± 2.9) (p<0.05)。 しかし、E.coli処理は、より低いVero細胞生存率を引き起こしたが、その差は有意ではなかった(p<5 0 7 3>0.

L.rhamnosusは、図に示すように、HSV-1

に感染したマクロファージJ774細胞の生存率の増加を引き起こした。 図3に示すように、J774細胞の有意に増加した生存率は、L後に観察された。 HSV−1による感染前および感染後のJ7 7 4細胞のrhamnosus処理(非処理J7 7 4細胞およびE.coli処理J7 7 4細胞)(p<7 9 2 3>0.

細菌の存在下で炎症性サイトカインおよびNO産生を刺激した

J774細胞を、生または不活性のl.rhamnosusまたは大腸菌の懸濁液と共培養すると、no、TNF-α 大腸菌は、L.rhamnosus(p=0.019)と比較して有意に高いTNF-α産生を引き起こした。 TNF−α産生の顕著な誘導は、HSV−1による感染前および感染後の生きたe.coli懸濁液、ならびに不活性E.coliに曝露されたJ7 7 4細胞によって観察された(p=0. このような効果はL.rhamnosusでは見られなかった。 L.rhamnosusまたは大腸菌のライブまたは不活性懸濁液は、HSV-1感染J774細胞におけるNOまたはIFN-γ分泌を刺激しませんでした。

ディスカッション

臨床介入研究では、感染期間の短縮または特定のウイルス感染のリスクの減少を介して抗ウイルス効果を有する特定のプロバイオティクスを同定した。 最良の所見は、乳児および小児のウイルス性下痢に対するプロバイオティクスの有益な影響であった。32

選択された膣乳酸菌株(L.brevis CD2、L.salivarius FV2、L.plantarum FV9)の抗HSV-2効果に関する研究では、Conti et al. HSV-2に対する生きている細菌細胞の阻害効果を実証しました,このような結合/エントリなどのウイルス複製の初期段階との干渉を含むいくつかの機33

VSV感染したブタ上皮細胞株およびマクロファージ細胞株に対する様々な乳酸菌の保護効果を示す二つの別々の報告もある。34,11

プロバイオティクス株の実績のある抗ウイルス効果と、HSV-1感染を治療または予防するための適切なプロトコルを作成しようとする研究者の試

本研究では、Lのin vitro効果を評価しました。 rhamnosus、プロバイオティクス細菌、HSV-1感染に直接、およびマウス単球/マクロファージJ774細胞株のL.rhamnosus活性化後のプロ炎症性サイトカインとしてNOリリースとTNF-α

我々の結果は、L.rhamnosus曝露がJ774細胞株の生存率を最大90%向上させることを明確に示したが、これはIvecらによって報告された結果と比較して顕著である。 (VS V感染3D4/2 1細胞株の3 0%生存率)。 生存率の増加の原因は、2つの研究の間の細胞株、VSV感染能力対HSV-1、またはプロバイオティクス種の違いによるものであり得る。 また、ウイルス感染マクロファージの暴露に対する不活性細菌よりも生きている細菌のより多くの保護効果を検出し、Ivecらと一致する発見。さんのレポート。 ウイルス粒子に対するプロバイオティクス細菌の保護効果に関与するメカニズムは、細胞表面付着のための競争である。 これはすでにin vitroで証明されており、VSV感染の場合の細胞の保護のための実行可能なメカニズムとして報告されている。6,11

細菌の不活性化中の細菌DNA中のCpGモチーフの保存は、アポトーシス経路を抑制し、細胞の生存率を高めることが報告されている。11,35我々の研究は、理由は不明であるが、大腸菌の治療と比較した場合、L.rhamnosusで処理されたHSV-1感染マクロファージJ774細胞の高い生存率を示した。 L.rhamnosusと比較して大腸菌曝露の場合の細胞生存率が低いことの一つの説明は,大腸菌によって誘導されるTNF-α産生の増加に関連しており,これはより多くの細胞アポトーシスを引き起こす。 本発明者らは、L.rhamnosusと比較して、細胞のE.coli曝露前および後のHSV−1感染によって誘導されるより多くのTNF−α産生を示した。 大腸菌の細胞壁のリポ多糖類の存在はTNF解放のための潜在的な刺激物です。36

L.rhamnosusに曝露されたJ774細胞の上清による感染Vero細胞の生存率の増加は、炎症性サイトカインとしてのNO、TNF-αおよびIFN-γ産生に起因する可能性があ11,15これはHSV-1増殖を抑制した。 NOリリースはまた、以前に報告されている別の抗ウイルス機構ではありません。 実際、IFN-γの存在下でプロバイオティクス細菌に曝露された同時インキュベートされたマクロファージでは、NO放出の有意な増加が報告された;しかし、Ivec et al. IFN-γはNO放出の刺激において重要な因子ではないと述べた。11,37

我々の研究では、生きているか、または不活性なL.rhamnosusまたは大腸菌と共インキュベートJ774細胞は、TNF-α、IFN-γおよびNO産生を誘導することができた。 IFN-γとその依存メディエーター N Oの濃度は以前の報告よりも低かった。 しかし、その報告では、プロバイオティクス細菌に外因性IFN-γを適用したので、IFN-γとプロバイオティクス細菌との同時存在は、高レベルのNO.37の産生に必要であると結論づけることができる不活性細菌の場合、ペプチドグリカン、リポテイコ酸およびCpGモチーフなどの細胞壁成分は、細胞によるNO、TNF-αおよびIFN-γ産生を誘導することができるが、それらのレベルは生きた細菌曝露によって誘導されるものよりも低かった。11

rhamnosusは、細胞表面付着のためのウイルスと競合すること、マクロファージの生存率を増加させること、炎症性応答の刺激に続いて、異なるメカニズムを介 したがって、我々の結果は、HSV-1感染共療法の可能性のある候補として、細胞内の免疫防御を増加させるためのL.rhamnosusの将来のin vivo評価を示唆している。

謝辞

この記事は、医学微生物学のためのSoghra KhaniのMSc論文から取られ、Shiraz University Of Medical Sciences Grant No.4008によって財政的に支援されました。 また、Pedram Taleazadeh Shirazi氏の技術支援に感謝したいと思います。

利益相反

すべての著者は利益相反を持たないと宣言しています。

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